梯度PCR儀常見問題的主要解決方案分享

　　梯度PCR儀常見問題的主要解決方案：

　　1.梯度PCR儀在產物序列中引入了錯誤

　　這是由于聚合酶忠實性低或者循環數太多，這時需要使用帶有校正活性的熱穩定聚合酶，同時降低循環數。此外，四種dNTP的濃度不同也會出現該問題，此時應制備新的濃度相同的dNTP混合物。

　　2.PCR跑膠

　　該現象表現為目的條帶很亮，但是邊沿不清楚，前后有拖尾現象。出現這樣的問題，則需要進行細致的分析，因為引起該問題的可能很多。可先檢查是否模板質量問題，如有降解等，模板應避免反復凍融。也有可能是抽提RNA時有污染，則需要重新抽提RNA。此外，也可能是非特異性擴增引發該問題，可提高退火溫度，少循環次數。電泳緩沖液時間太長，ph值和鹽離子濃度明顯改變、電泳時電壓太高、電泳液過久沒換，電泳膠臟了等都可能引發該問題。如果不是由上述原因引起，則進一步檢查加樣量是否過大，制膠過程中膠孔是否制好，EB是否沖洗干凈、模板中是否混有基因組DNA或蛋白等。也需考慮是否擴增的條件不合適。針對具體原因再采取相應的措施。

　　3.對梯度PCR儀產物需要用凝膠純化的時間掌控

　　當凝膠分析擴增產物只有一條帶時，則無需使用凝膠純化；

　　當可見其他雜帶時，則可能是積累了大量引物的二聚體，在克隆前需要做凝膠純化。