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PCR儀反應(yīng)體系異常狀況分析
點(diǎn)擊次數(shù)：2023 更新時(shí)間：2021-12-21
PCR儀擴(kuò)增可設(shè)置一系列不同的退火溫度條件（通常12種溫度梯度）。因?yàn)楸粩U(kuò)增的不同的DNA段其適合的退火溫度不同，通過(guò)設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，從而一次性PCR擴(kuò)增就可以篩選出表達(dá)量高的適合退火溫度進(jìn)行有效的擴(kuò)增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增，這樣既節(jié)約時(shí)間，也節(jié)約經(jīng)費(fèi)。在不設(shè)置梯度的情況下亦可當(dāng)做普通的PCR用。正真的梯度，是每一排管都有準(zhǔn)確的加熱控溫探頭。其他的都是從兩頭的熱傳遞來(lái)設(shè)計(jì)控溫，它多應(yīng)用于科研、教學(xué)機(jī)構(gòu)。
PCR儀的反應(yīng)體系出現(xiàn)異常狀況時(shí)的分析：
一、非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)
當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物不止一種時(shí),通常與以下幾種情況有關(guān)：
1.背景DNA與引物同源性高，可通過(guò)在兩個(gè)引物的內(nèi)側(cè)序列上再使用另一對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物DNA再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
2.退火溫度太低，引物和模板的配對(duì)是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程,分子的熱運(yùn)動(dòng)使引物與模板結(jié)合與解離而達(dá)到佳配對(duì)位點(diǎn)上，退火溫度太低,造成引物與模板的非特異性位點(diǎn)部分配對(duì)而解離不下來(lái),這種不正確的配對(duì),進(jìn)入PCR反應(yīng)過(guò)程就可擴(kuò)增出非特異性的產(chǎn)物DNA，提高退火的溫度將可改善結(jié)果；
3.過(guò)量的酶,Mg2+,引物和模板DNA可使PCR反應(yīng)造成混亂,強(qiáng)行擴(kuò)增出非特異性產(chǎn)物DNA,適當(dāng)降低這些試劑的量有助于問(wèn)題的解決。
二、無(wú)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物帶
1.引物溶液反復(fù)凍融或污染了DNA酶類,造成引物降解；
2.模板DNA制備時(shí)模板已降解；
3.Taq酶有失活或有雜酶污染；
4.緩沖液條件不當(dāng)；
5.引物不正確。
